Detalle:

La Esclerosis Lateral Amiotrófica es un desorden neurodegenerativo, progresivo e incapacitante, caracterizada por la degeneración de las motoneuronas superiores de la corteza cerebral, las motoneuronas inferiores del tronco cerebral y motoneuronas de la médula espinal. La edad de inicio de esta enfermedad es variable, generalmente, suele originarse en la edad adulta, en torno a los 40-60 años.

La neuropatología asociada a esta enfermedad presenta diferentes aspectos, como pueden ser la degeneración de las motoneuronas, las inclusiones intracitoplasmáticas y la neuroinflamación, caracterizada por aumento de la microgliosis y astrogliosis, tanto de la corteza motora como de la médula espinal. En la actualidad se desconocen los mecanismos que subyacen el inicio de esta enfermedad, sin embargo, las investigaciones realizadas durante los últimos años han permitido determinar ciertos mecanismos que están involucrados en la ELA, entre ellos se encuentran el estrés oxidativo, la desregulación del tráfico axonal, la excitotoxicidad mediada por glutamato, alteraciones en el metabolismo del RNA y alteraciones en la homeostasis proteica.

El diagnóstico de esta patología se realiza a través de los criterios de El Escorial Revisados y de los criterios de Awaji, que aumentan el valor de la electrofisiología para el diagnóstico de la ELA. Una de las pruebas electrofisiológicas utilizadas para evaluar la excitabilidad de las motoneuronas, así como la fisiología básica de los reflejos de los segmentos espinales, además de su relación con ciertos signos clínicos de diversos síndromes de motoneurona superior, es el reflejo de Hoffmann o reflejo H. Esta técnica se basa en estimular eléctricamente las fibras sensoriales Ia en un nervio periférico y registrar el reflejo de respuesta en el músculo homónimo.

Se han desarrollado numerosos modelos animales para el estudio de esta enfermedad, prácticamente todos basados en las mutaciones causantes de la patología familiar, esto hace que estos modelos no representen a la mayoría de los pacientes, ya que el 90% de ellos presentan una patología esporádica.

El LCR de los pacientes de ELA ha demostrado ser citotóxico para las motoneuronas en cultivo, lo que hizo plantear que el LCR podría ser un medio de difusión de la enfermedad y, que la infusión continua de este LCR intraventricular en roedores sería un buen modelo para estudiar la patología esporádica.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para este estudio, se han diseñado dos modelos animales en rata, uno Agudo y otro Crónico, para evaluar el efecto tanto neuropatológico como electrofisiológico de la administración, vía intracerebroventricular, de LCR Citotóxico de pacientes de ELA. En el Modelo Agudo se procedió a implantar una mini bomba osmótica ALZET® modelo 1002, rellena de LCR Control o LCR Citotóxico respectivamente, consiguiendo una infusión continua durante 14 días. Por su parte en el Modelo crónico se implantaron 3 bombas osmóticas ALZET® modelo 2002, rellenas de LCR Control, LCR No Citotóxico y LCR Citotóxico respectivamente, con ello se mantuvo una infusión continua durante 42 días.

Durante todo el periodo de estudio, a los animales se les realizó semanalmente un EMG para evaluar los cambios en el reflejo H producidos por la infusión del LCR correspondiente. En cada EMG se procedió a realizar dos protocolos, uno de intensidades y otro de frecuencias, para ver como afectaba la intensidad y frecuencia del estímulo a las amplitudes de las ondas M y H del sóleo.

A los animales del Modelo Crónico también se les realizaron pruebas de comportamiento, para evaluar las características clínicas que presentaban. Concretamente, se realizaron los test de Matsumoto, Plano Inclinado y el Análisis de las huellas.

Finalizado el periodo de infusión, se procedió al sacrificio de los animales mediante perfusión intracardiaca y se extrajeron tanto el cerebro como la médula espinal para realizar los estudios neuropatológicos. Se realizaron cortes de 30 μm, tanto de las regiones de corteza motora, como de los segmentos cervicales y lumbares de la médula espinal.

Tras ello, se realizaron inmunohistoquímicas para evaluar, tanto el proceso neurodegenerativo (se utilizaron marcadores de neuronas y motoneuronas, así como marcadores de inclusiones y apoptosis), como el proceso neuroinflamatorio (utilizando marcadores de microglía y astrocitos, además, en el Modelo Crónico se analizó la polarización de la microglía). Todos los resultados inmunohistoquímicos se revelaron mediante microscopía confocal y posteriormente se analizaron mediante el software ImageJ v. 1.8.  Para los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVAS y T-Test a través de los softwares IBM SPSS statistics 25 y GraphPad Prism 8.

RESULTADOS

Todos los animales incluidos en este estudio sobrevivieron al implante de la bomba osmótica y en ningún momento del estudio presentaron signos de infección, ni convulsiones, agresividad, piloerección o postración, todos ellos signos o síntomas relacionados con el dolor y sufrimiento. En los estudios electrofisológicos tampoco hubo complicaciones, no viéndose afectados en ningún momento por la anestesia inhalatoria con isoflurano.

Los resultados histológicos han mostrado que en el Modelo Agudo existe un proceso neuroinflamatorio activo, tanto en la corteza motora como en la médula espinal, encontrándose un aumento de la microgliosis, que además presentaba un fenotipo activado. Además, en ambos tejidos también se observó un aumento de la astrogliosis. Por otro lado, en este modelo se evidenció un proceso neurodegenerativo caracterizado por una reducción en el número de neuronas general y más concretamente, una pérdida motoneuronal. Sumado a esto las motoneuronas que sobrevivieron mostraban un aumento de las inclusiones intracitoplasmáticas.

Por su parte, los resultados histológico han mostrado, que en el Modelo Crónico existe un proceso neuroinflamatorio activo tanto en la corteza motora como en la médula espinal, encontrándose un aumento de la microgliosis, que además, presentaba un fenotipo activado, que al analizarlo de forma más profunda, indicaba que en el Grupo No citotóxico esta microglía activada está en un fenotipo antiinflamatorio, mientras que la del Grupo Citotóxico presentaba un fenotipo proinflamatorio. Así mismo, queda demostrado un aumento del marcaje de MHCII. Además, en ambos tejidos también se observó un aumento de la astrogliosis. Por otro lado, en este modelo se evidenció un proceso neurodegenerativo caracterizado por una reducción en el número de neuronas general, y más concretamente, una pérdida motoneuronal. Sumado a esto las motoneuronas que sobrevivían mostraban un aumento de las inclusiones intracitoplasmáticas.

Los resultados electrofisiológicos han demostrado que existe alteración de las ondas M y H, en ambos modelos. Se observan alteraciones en tanto en la onda M indicativo de una pérdida motora directa, así como en la onda H lo que indica alteraciones en las sinapsis con las neuronas aferentes lo que presenta relación con lo encontrado en la histología.  Los resultados relativos a las características clínicas indicaron que, los animales del Modelo Crónico no mostraban alteraciones en ninguna de las pruebas realizadas, indicativo de que estos animales no presentaban alteraciones funcionales en este periodo de estudio.

DISCUSIÓN

Actualmente no existe ningún modelo animal que represente en su totalidad a la patología de la ELA, además hay que tener en cuenta que la mayoría de los modelos generados hasta el momento están basados en las mutaciones que provocan las variantes familiares y que solo representan al 10% de los casos. Es por ello, que la búsqueda de un modelo que represente a la patología esporádica es de vital importancia.

El principal hallazgo encontrado en estos modelos es una activación del proceso neuroinflamatorio, así como una marcada neurodegeneración tanto en la corteza motora como en la médula espinal. Estos dos hallazgos son dos de las principales características observadas en los pacientes de ELA, así como en los modelos animales.

Así mismo, se encuentran alteraciones electrofisiológicas que correlacionan con la degeneración neuronal observada en los resultados histológicos. Se han observado alteraciones, en tanto en la onda M, indicativo de una pérdida motora directa, como en la onda H, lo que indica alteraciones en las sinapsis con las neuronas aferentes lo que presenta relación con lo encontrado en la histología. Estos resultados corroboran lo encontrado en los pacientes de ELA, así como en modelos animales en los que se observan alteraciones en este reflejo y en otros estudios electrofisiológicos.

La infusión del LCR en el ventrículo lateral durante el periodo de estudio no altera la clínica de los animales, lo que indicaría que estos animales podrían encontrarse en una fase presintomática de la patología y sería necesario un mayor tiempo de estudio para evidenciar la afectación clínica.

CONCLUSIONES

El líquido cefalorraquídeo de algunos pacientes de ELA es citotóxico para las motoneuronas en cultivo.

La infusión intracerebroventricular continua, tanto aguda como prolongada de líquido cefalorraquídeo citotóxico de pacientes de ELA en rata provoca alteraciones histológicas en la corteza motora y en los segmentos cervicales y lumbares de la médula espinal compatibles con lo hallado en la patología humana.

Requisitos:

No aplica.